Fluorescensresonansenergioverføring (FRET)
Fluorescensresonansenergioverføring (FRET) er en ikke-strålingsenergioverføringsprosess der donoreksiterte energien overføres til akseptoreksiterte tilstanden gjennom samspillet mellom intermolekylære elektriske par.Denne prosessen involverer ikke fotoner og er derfor ikke-strålende.Denne analysen har fordelene ved å være rask, følsom og enkel.
Fargestoffet som brukes i FRET-analysen kan være identisk.Men i de fleste bruksområder brukes faktisk forskjellige fargestoffer.Kort fortalt er overføringen av lysresonansenergi overføringen av et par dipoler fra donoren (fargestoff 1) til akseptoren (fargestoff 2) når donorgruppen er eksitert.Generelt overlapper emisjonsspekteret til donorfluoroforgruppen med absorpsjonsspekteret til akseptorgruppen."Når avstanden mellom de to fluoroforene er passende (10 - 100 A), kan overføringen av fluoroforenergi fra donor til akseptor observeres."Metoden for energioverføring avhenger av den kjemiske strukturen til reseptoren:
1. Omdannes til molekylær vibrasjon, det vil si at det lysende lyset for energioverføring forsvinner.(Reseptoren er en lysslukker)
2. Emisjonen er mer intens enn selve reseptoren, noe som resulterer i en rødforskyvning i det sekundære fluorescensspekteret.»(Reseptorer er lysgivere).
Donorgruppen (EDANS) og akseptorgenet (DABCYL) er jevnt knyttet til det naturlige substratet til HIV-protease, og når substratet ikke er frakoblet, kan DABCYL stanse EDANS og deretter bli uoppdagelig for fluor.Ved frakobling av HIV-1-protease blir EDANS ikke lenger slukket av DABCYL, og EDANS-luciferaser kan deretter påvises.Tilgjengeligheten av proteasehemmere kan overvåkes ved endringer i fluorescensintensiteten til EDANS.
FRET-peptider er praktiske verktøy for å studere peptidase-uspesifisitet.Siden reaksjonsprosessen kan overvåkes kontinuerlig, gir den en praktisk metode for å påvise enzymaktivitet.Glansen som produseres etter hydrolysen av peptidbindinger av giveren/akseptoren gir et mål på enzymaktivitet ved nanomolare konsentrasjoner.Når FRET-peptidet er intakt, viser det en plutselig forsvinning av den interne flashen, men når en hvilken som helst peptidbinding på motsatt side av donoren/akseptoren bryter, frigjør det en flash, som kan detekteres kontinuerlig og enzymaktiviteten kan deretter kvantifiseres.
Innleggstid: 14. august 2023